單孢分離法的(黑木耳的分離單孢方法是什么?)

1.黑木耳的分離單孢方法是什么?

分離單孢的方法很多，有平板稀釋法、平板劃線分離法、稀釋涂布法、液滴分離法、毛細管分離法等。

我們采用的是平 板稀釋法，即將收集到的木耳孢子用無菌水稀釋至合適濃度， 將孢子懸液接入平皿中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后挑取大量單菌落， 接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中插有蓋玻片。菌絲萌 發(fā)后取出玻片一一鏡檢，將無鎖狀聯(lián)合的單核菌絲編上號作 雜交材料。

將兩個不同親本經(jīng)鏡檢無鎖狀聯(lián)合的單核菌絲A, B分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管的上下部，待兩 單核菌絲生長相遇時，取連接處的一小塊菌絲（經(jīng)鏡檢有鎖狀 聯(lián)合者即為雜交菌絲C）接種于另一空白培養(yǎng)基試管中央，在 它的上下部分別接兩個親本菌絲A和B，觀察雜交菌絲C與 親本菌絲A,B有無拮抗線。如有明顯的拮抗線，即表示該配 對為雜交菌絲，則保留；沒有拮抗線而長到一起的不是雜交菌 絲，則淘汰。

2.草菇單孢分離法育種方法是什么?

單孢分離是一種可以獲得純菌種的方法，主要就是將采集到的孢子群分開培養(yǎng)，讓它們單獨萌發(fā)成菌絲。

通過對草菇進行有性分離育種，然后選育出草菇菌株。表明草菇的孢子分離菌株，不管是在菌絲形態(tài)，還是生長速度和產(chǎn)厚垣孢子的能力方面，以及出菇率和產(chǎn)量等性狀上都存在比較大的差異。

我們可以在菌絲生長比較濃密的地方及能產(chǎn)生大量厚垣孢子的菌株中，選擇到產(chǎn)量較高的菌株在生產(chǎn)中應用，可以在一定程度上解決草菇生產(chǎn)上出現(xiàn)的菌種老化、退化問題。單孢分離法主要的步驟：菇種的選擇首先是對藤種進行選擇，并進行一系列的消毒處理。

努力收集質量比較好的單孢子。 單孢子的分離和涂布選擇一種適合自己的方法獲得單孢子，并對單孢子進行分離，單孢子的分離可采用單孢子分離器法和平板劃線分離法。

然后進行孢子涂布，在滅菌培養(yǎng)基上把獲得的單孢子均勻涂開。單孢子培養(yǎng)在保持溫度大約在35℃-40℃恒溫下，把單孢子培養(yǎng)至長成純菌絲，然后按可育性菌株的培養(yǎng)特征，把符合條件的菌株留作母種。

擴大母種把培養(yǎng)好的單孢子擴大培養(yǎng)成原種和生產(chǎn)種。出菇測驗把母種培養(yǎng)成原種和生產(chǎn)種后，就要開始對出菇進行試驗，經(jīng)過初篩和復篩，把出菇早、出菇均勻、粒大、菇形好、產(chǎn)量高的菌種篩選保留。

選擇一小塊試驗田進行試種，檢驗出菇率的穩(wěn)定性。小面積試種成功后，就可擴大實驗田的面積，繼續(xù)進行出菇率的確認。

最后就是把經(jīng)過確認的菇種，大面積推廣應用。

3.菌種孢子分離應怎樣操作

孢子分離為有性繁殖，所獲菌種已經(jīng)發(fā)生遺傳重組等變 異，生產(chǎn)性狀有可能優(yōu)于母體，也有可能劣于母體。

孢子分 離有單孢分離和多孢分離兩種方法，單孢分離主要用于遺傳育種研究，多孢分離多用于生產(chǎn)繁種。孢子分離技術如下：懸菇彈孢法：采集剛彈射孢子的子實體菌蓋，在無菌室經(jīng)消毒處理 后，將菌褶朝下懸吊于無菌容器內收集孢子，在22度?26°度 下讓其自然彈射孢子5?10小時，容器底部出現(xiàn)白色孢子 印。

取無菌水粘取少量孢子制成孢子懸浮液，用滅過菌的注射器或滴管吸取孢子懸浮液，滴1?2滴于試管斜面上，經(jīng) 25°度培養(yǎng)至孢子萌發(fā)，挑選無污染的斜面進行擴繁，經(jīng)過嚴 格的出菇試驗，擇優(yōu)用于生產(chǎn)。褶片粘貼法：在無菌條件下，選取一小塊子實體組織，蘸少量無菌瓊 脂或漿糊，粘附于試管培養(yǎng)基斜面的對面玻壁上，加棉塞后 在20度左右靜置，菌孔組織中的孢子會彈射到斜面培養(yǎng)基 上，再去掉試管壁上的菌塊，進一步培養(yǎng)獲得多孢子萌發(fā)的 菌絲體。

4.什么是孢子分離法

孢子分離法也稱為孢子彈射分離法，是利用某些藥用真菌子實體成熟后自行彈射孢子的特性，在無菌條件下，使彈射的孢子落到適宜培養(yǎng)基上，在適宜條件下進行培養(yǎng)，孢子萌發(fā)成菌絲，從而獲得純菌種的一種方法。

（1） 分離材料的選擇與消毒孢子分離材料，來自于多年人工栽培的優(yōu)良品系和野生的種菇。 在同一個生長條件下，栽培同一種藥用真菌不同的品系，其生產(chǎn)效益和品質有很大差異；而同一個品系栽培在不同的環(huán)境條件下，其優(yōu)良性狀表現(xiàn)也不同，就是在相同環(huán)境條件下栽培的同一個品系，其單株之間也會出現(xiàn)差異。

因此，應選擇長期栽培的優(yōu)良品種的優(yōu)良單株作為分離材料。 野生的菌株，未經(jīng)過人工栽培，不知其優(yōu)良性狀、抗逆能力和生產(chǎn)性能如何，只能作為育種搜集原始材料時進行孢子分離，經(jīng)過培養(yǎng)品系之間對比試驗，選擇優(yōu)良者進行生產(chǎn)，在選優(yōu)去劣的培養(yǎng)過程中，再在群體中選擇優(yōu)良個體，作為孢子分離的材料。

理想的種菇應該是具有該品種主要典型的特征，發(fā)育正常，個體健壯，無病蟲害，成熟適度的子實體。 種菇選定后，可將其周圍 10厘米左右范圍內的小菇全部摘除，適當增加噴水量，有的藥用真菌子實體有菌幕包著，即可待種菇有八、九分成熟時，及時采摘進行消毒。

可剪去菌柄的三分之二，用清水洗去黏附的污物，浸入0。 1%的升汞溶液中1~2分鐘或在70%的酒精中浸幾秒到1分鐘，取出后用無菌水反復沖洗數(shù)次，用滅菌的紗布或濾紙吸干表面水分后待用。

有些藥用菌如香菇的子實體，很小時菌幕就被拉開；或有的種類根本無菌幕，菌褶裸露于空氣中，很難避免有雜菌孢子附著在菌褶上，則應采摘成熟的子實體，剪去三分之二的菌柄，用 75%的酒精揩擦菌蓋及菌柄表面，并在插人孢子收集器后6~12小時內，種菇孢子已彈出而附在上面的雜菌孢子短時間內還未脫落時取出子實體。 而對于膠質菌類的子實體，只能用無菌水洗滌，用無菌紗布吸干表面水分后待用。

（2） 孢子的采集種菇經(jīng)消毒處理后，即可采用以下方法收集孢子。孢子彈射采集法：利用孢子自動彈射出子實層的特性，采集孢子。

一般采用整株插種法、三角瓶鉤懸法和試管貼附法，全部操作過程都應該在無菌條件下進行。 ① 整株插種法：適于傘菌類孢子的采集。

首先應準備好孢子采集器，用搪瓷盤或大于鐘罩的培養(yǎng)皿作底盤，上面放一個小培養(yǎng)皿，皿內放一個不銹鋼的支架，用鐘罩蓋在小培養(yǎng)皿上，將整套孢子采集器用雙層紗布或報紙包好，經(jīng)高壓滅菌后備用。在無菌條件下打開孢子采集器，揭去鐘罩，為了防止鐘罩與培養(yǎng)皿接觸處雜菌侵人和增加采集器內部的濕度，在大培養(yǎng)皿內鋪 2~3層滅菌的紗布或脫脂棉，倒人0。

1 %的升汞液，以浸濕紗布為度，然后放人小培養(yǎng)皿，將消毒后的子實體插在支架上蓋鐘罩后，根據(jù)不同分離對象，移至18~25°C條件下，培養(yǎng)6小時至2天，待小皿內彈射并沉積一層孢子后，移入無菌室，先用75%的酒精或0。1%升汞擦拭鐘罩外部，打開鐘罩取出子實體，小培養(yǎng)皿加蓋密封，供分離用。

② 三角瓶鉤懸法：適用于不具菌柄子實體孢子的采集，如膠質菌銀耳、木耳等。在無菌條件下，將耳片用無菌水沖洗數(shù)次后，用無菌紗布吸干水分，將耳片掛在金屬鉤上，鉤子的另一端掛在三角瓶口上，瓶內裝有PDA培養(yǎng)基，加棉塞，置25°C溫度下培養(yǎng) 1~2天，當培養(yǎng)基表面有一層孢子粉時，把三角瓶拿到無菌室取出耳片和鉤子，仍塞好棉塞繼續(xù)培養(yǎng)。

③ 貼附法：取一塊經(jīng)消毒的成熟菌褶或耳片，用滅菌的瓊脂或漿糊，黏附在裝有PDA培養(yǎng)基的試管斜面或培養(yǎng)皿皿蓋正上方，加棉塞或蓋皿蓋后置室溫下培養(yǎng)，待孢子自然落下后，在無菌室內懾除菌褶或耳片，或將落有孢子的培養(yǎng)基轉移在新的試管斜面及培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)基上，加塞或加蓋后繼續(xù)培養(yǎng)。 ④ 孢子印采集法：取成熟的子實體經(jīng)表面消毒后，切去菌柄，置于滅過菌的白色或黑色蠟光紙上，罩上通氣鐘罩，在24°C下靜置數(shù)小時后，輕輕移去種菇，可見有大量孢子落在紙上。

將有孢子印的紙在無菌條件下保存?zhèn)溆?。?菌褶涂抹法：在接種室內，將成熟的子實體表面消毒，去掉菌柄，用消毒的接菌環(huán)插入兩片菌褶之間，輕輕涂抹褶片，將尚未彈射的孢子沾在接種環(huán)上，然后用劃線法接種在準備好的斜面培養(yǎng)基上或平板培養(yǎng)基上。

操作時，要嚴格在無菌條件下，動作要準確。⑥ 空中孢子捕捉法：傘菌子實體成熟后，孢子大量彈射，在子實體周圍可見煙霧狀的“孢子云”，將準備好的培養(yǎng)基平板或試管口迎著“孢子云”方向，使孢子附著在培養(yǎng)基表面，隨即蓋上皿蓋或加棉塞即可。

（3） 孢子的分離采集到的孢子，一般需要經(jīng)過分離選擇后，才能制作原種。 孢子的分離根據(jù)接種到培養(yǎng)基上的孢子數(shù)量而分單孢分離和多孢分離兩種。

有些菇類的孢子，具有單孢結菇的能力，可采用單孢分離純菌種的方法；有些種類如香菇、木耳、金針菇等藥用真菌的單孢菌絲，只有經(jīng)過質配后才能結菇，多采用多孢分離法，多孢分離方法簡單、易操作、沒有不孕現(xiàn)象，在生產(chǎn)上常采用；但不能選擇優(yōu)良單孢繁殖后代，如果進行雜交育種時，仍應進行單孢分離。 單孢分離：從采集到的孢子群中，挑出單個孢子進行培養(yǎng)，單。