遺傳多樣性的檢測(cè)方法(遺傳多樣性的檢測(cè)方法)

1.遺傳多樣性的檢測(cè)方法

檢測(cè)遺傳多樣性的方法隨生物學(xué)尤其是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展而不斷提高和完善。從形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)（染色體）水平、生理生化水平、逐漸發(fā)展到分子水平。然而不管研究是在什么層次上進(jìn)行，其宗旨都在于揭示遺傳物質(zhì)的變異。任何檢測(cè)遺傳多樣性的方法，或在理論上或在實(shí)際研究中都有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限，還找不到一種能完全取代其它方法的技術(shù)。因此，包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及同工酶和DNA 技術(shù)在內(nèi)，各種方法都能提供有價(jià)值的資料，都有助于我們認(rèn)識(shí)遺傳多樣性及其中的生物學(xué)意義。

2.遺傳多樣性的研究方法

PCR特異擴(kuò)增ITS序列

這是目前鑒定物種和做分子分類研究的最主流的方法.原理是：ITS序列是中度重復(fù)序列，廣泛分布于基因組并且是同步進(jìn)化的，而且不同物種間進(jìn)化差異很大，它的堿基序列同源性的程度決定生物之間的親源關(guān)系遠(yuǎn)近，并可以以此來(lái)作為分類依據(jù)劃分物種.另外對(duì)于未知物種，可以通過(guò)與GENEBANK提供的序列比對(duì)來(lái)確定該物種的分類歸屬，達(dá)到鑒定的目的.ITS序列在核糖體大小亞基的rRNA之間，核糖體大小亞基的rRNA序列非常保守，便于設(shè)計(jì)PCR過(guò)程所需的兩端特異性引物，進(jìn)行典型的錨定PCR.

差異顯示PCR

可以用來(lái)研究同一個(gè)體不同生長(zhǎng)時(shí)段和不同組織（或分化結(jié)構(gòu)）或者不同個(gè)體之間基因表達(dá)差異.原理是：根據(jù)中心法則，每一個(gè)閱讀框要表達(dá)必須先轉(zhuǎn)錄成mRNA.那么在不同細(xì)胞內(nèi)只要存在基因差異表達(dá)現(xiàn)象，肯定就會(huì)存在不同的mRNA.我們可以提取細(xì)胞的mRNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此來(lái)作為PCR模板.由于mRNA的3端具有polyA特殊結(jié)構(gòu)，因此可以這樣設(shè)計(jì)引物：引物1與cDNA的polyT互補(bǔ)，引物2隨機(jī)合成大約10bp左右.PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).這樣通過(guò)PCR就可以顯示并放大出mRNA的差異，從而找到差異表達(dá)的基因.

RFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多樣性）

基于RFLP（限制性酶切片段多樣性） 和PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種用來(lái)研究分類的技術(shù).原理是：不同物種的DNA序列不同，那么用同種限制性內(nèi)切酶酶切會(huì)得到不同的片段，這些不同的片段中，有很多長(zhǎng)度也會(huì)有不同.通過(guò)同樣兩種限制性內(nèi)切酶消化后，根據(jù)酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列并額外添加一段特異性序列，用T4連接酶補(bǔ)平，經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增（預(yù)擴(kuò)增和二次擴(kuò)增），產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染色后用專門的分析軟件分析，根據(jù)條帶分布差異的程度來(lái)劃分物種間的親緣關(guān)系.

3.PCR怎么檢測(cè)遺傳的多樣性

遺傳多樣性可以通過(guò)檢測(cè)基因多態(tài)性來(lái)獲得信息。

檢測(cè)基因多態(tài)性的方法有很多，包括你所說(shuō)的PCR方法。以下是介紹。

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最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測(cè)，后來(lái)采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與限制酶酶切相結(jié)合的方法。現(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。

2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測(cè)方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，就會(huì)形成不同的構(gòu)象。

在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后，進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí)，靶DNA中若發(fā)生單個(gè)堿基替換等改變時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位（mobility shift），多用于鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3.PCR-ASO探針?lè)ǎ≒CR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)āＴ赑CR擴(kuò)增DNA片段后，直接與相應(yīng)的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。

其原理是：用PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交，針對(duì)每種突變分別合成一對(duì)寡核苷酸片段作為探針，其中一個(gè)具有正常序列，另一個(gè)則具有突變堿基。突變堿基及對(duì)應(yīng)的正常堿 基勻位于寡核苷酸片段的中央，嚴(yán)格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補(bǔ)的等位基因片段才顯示雜交信號(hào)，而與探針中央堿基不同的等位基因片段不顯示雜交信號(hào)，如果正常和突變探針都可雜交，說(shuō)明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說(shuō)明突變基因?yàn)榧兒献樱舨荒芘c含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應(yīng)的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。

若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。4. PCR-SSO法：SSO技術(shù)即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。

原理是PCR基因片段擴(kuò)增后利用序列特異性寡核苷酸探針，通過(guò)雜交的方法進(jìn)行擴(kuò)增片段的分析鑒定。探針與PCR產(chǎn)物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)的原則。

探針可用放射性同位素標(biāo)記，通過(guò)放射自顯影的方法檢測(cè)，也可以用非放射性標(biāo)記如地高辛、生物素、過(guò)氧化物酶等進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記物檢測(cè)。5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據(jù)各等位基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出一套針對(duì)每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 （group-specific）的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。

SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補(bǔ)性結(jié)合，通過(guò)PCR特異性地?cái)U(kuò)增該基因片段，從而達(dá)到分析基因多態(tài)性的目的。6. PCR-熒光法：用熒光標(biāo)記PCR引物的5'端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒光標(biāo)記的多種引物同時(shí)參加反應(yīng)，PCR擴(kuò)增待檢測(cè)的DNA，合成的產(chǎn)物分別帶有引物5'端的染料，很容易發(fā)現(xiàn)目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測(cè)序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由于PCR技術(shù)的應(yīng)用，使得DNA 測(cè)序技術(shù)從過(guò)去的分子克隆后測(cè)序進(jìn)入PCR直接測(cè)序。PCR產(chǎn)物在自動(dòng)測(cè)序儀上電泳后測(cè)序。

常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法；Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法；DNA測(cè)序的自動(dòng)化。目前DNA順序全自動(dòng)激光測(cè)定法是最先進(jìn)的方法。

8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實(shí)用于快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個(gè)體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產(chǎn)生的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的大小、數(shù)目和位置各異，由于同質(zhì)雙鏈和異質(zhì)雙鏈之間的分子構(gòu)象不同。

因此，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經(jīng)過(guò)酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長(zhǎng)度不等的雜交帶，雜交帶的數(shù)目和分子量的大小具有個(gè)體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒(méi)有兩個(gè)人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋（gene finger-printing）。

9. 基因芯片法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過(guò)與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。

這一技術(shù)已用于基因多態(tài)性的檢測(cè)。對(duì)多態(tài)性和突變檢測(cè)型基因芯片采用多色熒光探針雜交技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性、定量及檢測(cè)范圍。

應(yīng)用高密度基因芯片檢測(cè)單堿基多態(tài)性，為分析SNPs提供了便捷的方法。10. AFLP(Amplication Fragment Length Polymorphism)法AFLP技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，。