文庫構(gòu)建方法(cDNA文庫的構(gòu)建方法)
1.cDNA 文庫的構(gòu)建有哪些方法
cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提?。ɡ绠惲蚯杷犭曳?，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。
這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。
2.基因文庫構(gòu)建的過程、原理及方法
1 cDNA 文庫的構(gòu)建 1.1 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理與方法 cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。
這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長文庫 經(jīng)典 cDNA 文庫的構(gòu)建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。
為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點所導致的局限性。
全長 cDNA 文庫，是指從生物體內(nèi)一套完整的 mRNA 分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質(zhì)序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。
目前所報道的對全長文庫的構(gòu)建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 （Invitrogen,USA） 使用說明進行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價 5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應(yīng)基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點，一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。
3'端：同樣可以用其它生物已知的對應(yīng)基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實驗方法證實 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE,3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質(zhì)量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細胞中表達信息（即 mRNA 種類）的完整性，它是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標。
文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構(gòu)建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。庫容量取決于來源細胞中表達出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數(shù)，1個正常細胞含10000~30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數(shù)群中所占比例少于0.5%時。
滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算（ P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設(shè)為99%;N 為文庫中以 P 概率出現(xiàn)細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù)；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數(shù)；T 為細胞中表達出的所有 mRNA 的總拷貝數(shù)）。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。
在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。
非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達具有重要的調(diào)控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)。
2 cDNA 文庫構(gòu)建的其它類型 2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因?qū)?yīng)的 cDNA 的拷貝數(shù)相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進行。
3.如何建立自己的文庫
文庫不需要建立，你注冊了百度帳號，就有自己的文庫了。
登錄百度知道后，在頁面上方點“文庫”，再在右上角點“個人文庫”，然后點“我的貢獻”，就進入你的文庫了。
在你的文庫里，可以看到你的文庫積分，以及你上傳或下載的文檔。
現(xiàn)在百度文檔可以復制，也可以免費收藏了。
復制方法：
打開百度文庫，用關(guān)鍵詞搜索你要的文檔。
找到文檔后，用鼠標把文檔的文字拉變色，然后松開鼠標，就能看到“復制”、“分享”，這兩個按扭了。
你點“復制”，就可以把文檔復制下來，粘貼到你的電腦里了。
收藏方法：
打開百度文庫，用關(guān)鍵詞搜索你要的文檔。
找到文檔后，打開文檔，在文檔的下面有“收藏此文檔”和“下載”兩個按扭
你點“收藏此文檔”，就可以把文檔收藏到你的文庫里了。
下載方法：
如果你文庫財富值足夠，去百度文庫搜索你想要的文檔直接下載就行了。
如果沒有文庫財富值，可以在知道里提問，求助其他網(wǎng)友幫你下載。
也可以先去賺文庫財富值，獲得文庫財富值方法：
1 上傳文檔
2 去評論別人的文檔（評論一次一分，每天最多加五分），和每天評論別人的文輯也可以（評論一次一分，每天最多加五分），一天共10分
3 注冊新的百度賬號，它會自動送你10分文庫財富
4 用百度Hi積分兌換文庫財富值，200百度Hi積分可兌換10分文庫財富值
5 給別人知道財富讓他幫你下載
6 做文庫任務(wù)，完成任務(wù)后會有財富值獎勵。
上傳文檔很難通過的，最好獲得文庫財富值的方法是第二種！
4.百度文庫如何建立
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創(chuàng)建文檔專輯 用戶在進入文庫首頁的某個分類后會看到分類下有文檔和文輯兩個選項卡，點擊文輯的選項卡后，會看到右上角有一個創(chuàng)建文輯的按鈕。 點擊創(chuàng)建文輯后，填寫文輯的標題、介紹、分類，然后為你的文輯填寫幾個關(guān)鍵詞（非必填項）。
文輯標題最好是能概括文輯中的文檔內(nèi)容，字數(shù)太少或太沒有明確的意義的話可能不利于文輯發(fā)揮作用。文輯的介紹是對這個文輯的一段介紹性的語句，方便讓其他的用戶更了解此文輯要傳達的意思。
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