植物組織培養(yǎng)的過程,植物組織培養(yǎng)依據(jù)的原理、培養(yǎng)過程的順序及誘導(dǎo)的植物激素分別是（　?。袤w細(xì)胞的全能性 ②離體植

（1）植物組織培養(yǎng)技術(shù)的原理是植物組織培養(yǎng)的過程：植物細(xì)胞具有全能性，即①；
（2）植物組織培養(yǎng)過程：離體植物器官、組織或細(xì)胞
脫分化

愈傷組織
再分化

根、芽→植物體，即②⑧⑥⑦③⑨；
（3）決定植物脫分化和再分化的關(guān)鍵因素是：植物激素的種類和比例，特別是生長素和細(xì)胞分裂素的協(xié)同作用在組織培養(yǎng)過程中非常重要，被稱為“激素杠桿”，因此誘導(dǎo)的激素為生長素和細(xì)胞分裂素，即④．
故選：A．

什么是植物組織培養(yǎng)？

聲明：本人是園藝專業(yè)教師，主講“植物組培”，“果樹栽培學(xué)”。

在無菌的條件下，將離體的植物組織，器官，細(xì)胞培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，人為

控制培養(yǎng)條件，使其生長，分化，增殖發(fā)育成完整的植株。從定義看有幾個(gè)特點(diǎn)：離體

，人工控制條件，無菌。

操作要求嚴(yán)格，一兩句說不清，想了解的話，單獨(dú)找我

組織培養(yǎng)怎么做，求步驟，求方法

要根據(jù)培養(yǎng)目的適當(dāng)選取材料，選擇原則：易于誘導(dǎo)、帶菌少。要選取植物組織內(nèi)部無菌的材料。這一方
面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取
材料，決不要在雨天、陰天或露水未干時(shí)取材料。因?yàn)榻训闹仓旰颓缣旃夂虾粑⒌慕M織，有自身消
毒作用，這種組織一般是無菌的。培養(yǎng)材料的消毒

從外界或室內(nèi)選取的植物材料，
都不同程度地帶有各種微生物。
這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，
便會(huì)造成
培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上。

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把?br>料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料
清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加
入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的
物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)
—
吐溫。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、無菌水、手表等。用
70%
酒精浸
10
～
30s
。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，
加之
70%
酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤時(shí)間不能過長。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花
蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用
70%
酒精處
理稍長的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取
1
—
2
種使用見表。第四步是用無菌
水涮洗，涮洗要每次
3min
左右，視采用的消毒液種類，涮洗
3-l0
次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑
殺傷植物細(xì)胞的副作用注意：①酒精滲透性強(qiáng)，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時(shí)間要短，防止酒精
殺死植物細(xì)胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時(shí)間長一些，如種子可以浸泡
5
分鐘。③升
汞的滲透力弱，一般浸泡
10
分鐘左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導(dǎo)致植物材料失綠，所
以對于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為
0.08
—
0.12%
的吐溫
20
或
80
（一種濕潤劑），可以
降低植物材料表面的張力，
達(dá)到更好的消毒效果。
滅菌劑

使用濃度
(%)
持續(xù)時(shí)間
（
min
）

去除的難易

效
果

次氯酸鈣

9~10 5~30
易

很好

次氯酸鈉

2 5~30
易

很好

氯化汞

0.1~1 5~8
較難

最好

抗菌素

4~50mg/L 30~60
中

較好

制備外植體

將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，
葉片則不需剝皮。在操作中嚴(yán)禁用手觸動(dòng)材料。

接種和培養(yǎng)

（一）接種

在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種
1
－
2
個(gè)，以防止交叉污染。（二）封口

接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。

（三）溫度

培養(yǎng)基大多應(yīng)保持在
25
℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區(qū)別對待。

增殖

外植體的增殖是組培的關(guān)鍵階段，
在新梢等形成后為了擴(kuò)大繁殖系數(shù)，
需要繼代培養(yǎng)。
把材料分株或切
段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖
1
個(gè)月左右
后，可視情況進(jìn)行再增殖。

根的誘導(dǎo)

繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽等一般沒有根，
必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
1
個(gè)月后即可獲得
鍵壯根系。

組培苗的煉苗移栽

試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進(jìn)入自然環(huán)境，必須進(jìn)行煉苗。一般移植前，
先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放
3
天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再
栽入已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前最好消毒。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強(qiáng)水分管理，保持較高的空氣濕度
（相對濕度
98
％左右），但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。

組織培養(yǎng)中的清洗、消毒滅菌技術(shù)

日期：
2010
年
4
月
1
日

來源：互聯(lián)網(wǎng)

作者：植物組培網(wǎng)

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2190

1
、
清洗

植物組織培養(yǎng)用的各種玻璃器皿，
特別是培養(yǎng)瓶和盛培養(yǎng)基的器皿，
一定要嚴(yán)格清洗，
以防油污、
重金屬離子、酸、堿等有害物質(zhì)殘留在瓶內(nèi)，影響培養(yǎng)物的生長。使用過的玻璃器皿應(yīng)及時(shí)清洗，先將污
物如培養(yǎng)基、培養(yǎng)物倒掉，再浸入水中，然后洗滌。玻璃器皿的洗滌，可根據(jù)器皿的污染程度和性質(zhì)，采
用不同的方法，通常有堿洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必須先進(jìn)行高壓消毒和煮沸，以殺死菌
體，否則會(huì)產(chǎn)生孢子飛揚(yáng)，污染環(huán)境，給組織培養(yǎng)帶來嚴(yán)重困難。器皿洗凈后，應(yīng)烘干或晾干，放在規(guī)定
的地方，便于取用。

常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱
(
烘燒和灼燒
)
、濕熱
(
常壓或高壓蒸
煮
)
、射線處理
(
紫外線、超聲波、微波
)
、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲
醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要
根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的
24h
內(nèi)完成滅菌工序。高
壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋
內(nèi)溫度也隨之增加。在
o
．
1MPa
的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)
121
℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)
菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有
幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，
通電后，待壓力上升到
O
．
05MPa
時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。三
次放氣后，關(guān)閥再通電，壓力表上升達(dá)
0
．
1-0
．
15Mpa
時(shí)，維持
15-20min
。
?
對高壓滅菌后不變質(zhì)的
物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，
既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時(shí)間。對于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)
服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌
20-30min
。高壓滅菌前后的培
養(yǎng)基，其
pH
值下降
0.2-0.3
單位。高壓后培養(yǎng)基
pH
值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌
前用堿調(diào)高
pH
值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅
菌后的
pH
值變化幅度較大，甚至可大于
2
個(gè)
pH
值單位。環(huán)境
pH
值的變化大于
0.5
單位就有可能產(chǎn)生
明顯的生理影響。
高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，
從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。
在
8%-20%
蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高
0
．
43
倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使
15%-25%
的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于
5.5
，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加
0.1%
活性炭
時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加
1%
活性炭，蔗糖水解率可達(dá)
5%
。

灼燒滅菌（用于無菌操作的器械

）
?
在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中，使
用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用
250
或
500ml
的廣口瓶，放入
95%
的酒精，以便插入工具。

干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到
160-180~C
的溫度來殺死微生物。由
于在干熱條件下，
細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，
接近芽抱的抗熱水平，
通常采用
170
℃持續(xù)
90min
來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用
耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到頂定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免
妨礙熱對流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅
菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。

過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)

）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，
不能用高壓滅菌處理，
通常采用過濾滅菌方法。
可用無菌的孔徑
0.20-0.45um
的硝酸纖維素膜過濾菌類，
當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，
常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過
濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。

紫外線和熏蒸滅菌（空間）
?(1)
紫外線滅菌

在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅
菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成
死亡。紫外線的波長為
200
—
300nm
，其中以
260nm
的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的
能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過
1.2m
為宜。

(2)
熏蒸滅菌

用加熱焚燒、
氧化等方法，
使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，
以殺死空氣和物體表
面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉
緊密，按
5
—
8ml
／
m3
用量，將甲醛置于廣口容器中，加
5g/m3
高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)
先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛?；瘜W(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物
的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。
一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所
以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和
酒精例外