紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)(估計(jì)蛋白質(zhì)濃度120mg/ml,如何用紫外線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量)
1.估計(jì)蛋白質(zhì)濃度120mg/ml,如何用紫外線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
您好！
① 1mg/ml蛋白質(zhì)濃度OD280約為1。
② OD值在0.2-0.8之間與蛋白濃度線性最好。
③ 因此120mg/ml的濃度，稀釋150-600倍之間測(cè)試比較合適。
④ 測(cè)試蛋白濃度，因考慮核酸的影響，因此應(yīng)該同時(shí)測(cè)定OD280及OD260，如果A280/A260>2，此時(shí)可以忽略核酸的影響； 如果A280/A260
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2.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)紫外法測(cè)定蛋白質(zhì)含量中哪些不良操作會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生
實(shí)驗(yàn)二、紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1.掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法
2.掌握紫外光分光光度計(jì)使用
【實(shí)驗(yàn)原理】
蛋白質(zhì)中含有酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基，在紫外光280nm波長處有最大吸收峰，故可用280nm的光吸收值（即光密度的大小）來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
由于核酸在280nm也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有干擾作用。但核酸的最大吸收峰在260nm，如同時(shí)測(cè)定260nm的光吸收，通過計(jì)算可以消除其對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響，因此溶液中存在核酸時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定280nm和260nm的光密度，方向通過計(jì)算測(cè)得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。
【實(shí)驗(yàn)操作】
1、稀釋血清（或其他蛋白質(zhì)溶液），準(zhǔn)確吸取0.1mL血清，置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（即500倍）。
2、測(cè)定光密度在紫外分光光度計(jì)上，將稀釋的蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色杯中，用生理鹽水做對(duì)照，測(cè)得280nm和260nm兩個(gè)波長的光密度。
【計(jì)算】
將測(cè)得280nm和260nm波長的光密度值按下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45D280-0.74D260
【附注】
1、不同的蛋白質(zhì)和核酸的光吸收率不完全是恒定不變，所以可能產(chǎn)生誤差。另外核酸中的嘌呤堿，嘧啶堿在波長260nm和280nm都有光吸收作用。所以核酸的含量在20%以下，D280/D260>1.5時(shí)，方可以使用上述公式。
2、本法對(duì)于微量蛋白質(zhì)的測(cè)定即快又方便，它還適應(yīng)于用硫酸銨或其他鹽類提純的蛋白質(zhì)樣品（這種蛋白質(zhì)樣品含多種鹽類混雜，用其他方法測(cè)定比較困難）。
3、如純系蛋白質(zhì)樣品，可根據(jù)該蛋白質(zhì)在280nm附近標(biāo)準(zhǔn)吸光系數(shù)，直接測(cè)定該蛋白質(zhì)的含量。如牛血清白蛋白的EI280（%)為6.3測(cè)定時(shí)，按下列公式計(jì)算。
樣品中牛血清白蛋白濃度（mg/mL）=D280/6.3*10
4、為簡(jiǎn)便起見，對(duì)于混合蛋白質(zhì)溶液，可用D280乘以0.75來代表其中蛋白質(zhì)的大致含量（mg/mL）。
3.求 怎樣用紫外分光光度法測(cè)蛋白質(zhì)含量
1、280nm的光吸收法
用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0 mg/mL。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。
2、280 nm和260 nm的吸收差法
核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280 nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260 nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm處的消光系數(shù)是280 nm處的2倍；而蛋白質(zhì)則相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。
3、215 nm與225 nm的吸收差法
蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225 nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。
4、肽鍵測(cè)定法
蛋白質(zhì)溶液在238 nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50~500 mg/mL已知濃度的5.0 mL蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238 nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。
擴(kuò)展資料：
紫外分光光度法原理
光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時(shí)，測(cè)量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級(jí)之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級(jí)譜，電子、振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
紫外-可見分光光度法是在190~800nm波長范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。
參考資料來源：百度百科-紫外分光光度法
4.紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本原理是什么
原理：蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外280nm波長處有最大吸收峰，其光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用280nm波長吸收值大小來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 快速
2. 對(duì)蛋白質(zhì)無破壞性
缺點(diǎn)：
1. 不是嚴(yán)格的定量方法。
因?yàn)榇朔ㄊ歉鶕?jù)酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基的強(qiáng)吸收值來測(cè)定的，不同的蛋白質(zhì)具有不同的消光系數(shù)。 另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中不含Tyr、Phe或Trp殘基時(shí)，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測(cè)粗提總蛋白濃度較為適宜）
2. 核酸可引起強(qiáng)烈干擾
