腸道菌群檢測方法(腸道致病菌的分類及常用檢測方法)

1.腸道致病菌的分類及常用檢測方法

根據(jù)可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量分類在腸道菌群中，可以培養(yǎng)到的細(xì)菌有400余種，依據(jù)其數(shù)量多少可以分為主要（優(yōu)勢）菌群（predominant microflora）和次要菌群（sub—dominant microflora）。

①主要（優(yōu)勢）菌群：指腸道菌群中數(shù)量大或種群密集度大的細(xì)菌，一般在10~10cfu/g以上，包括類桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬于原籍菌群。優(yōu)勢菌群是對宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。

②次要菌群：數(shù)量在10~10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過路菌群。檢測方法：1、采樣及稀釋 （1）按無菌操作法將檢樣25g（或25mL）放于含有225mL無菌水的三角瓶中（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。

固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以8000~10000r/min的速度離心1min，做成1:10的稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1Ml，注入含有9mL無菌水的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1:100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀釋液。

（3）根據(jù)食品的衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣品污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。

2、乳糖初發(fā)酵試驗 即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。

每一個稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。3、分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24h，然后觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色、鏡檢并作復(fù)發(fā)酵試驗。

4、乳糖復(fù)發(fā)酵試驗 即通常所說的證實試驗，其目的在于證明經(jīng)乳糖初發(fā)酵試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭陰性無芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述選擇性EMB培養(yǎng)基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1~2個進(jìn)行革蘭染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±l℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況。

凡乳搪發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭染色為陰性反應(yīng)的無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭染色為陽性，則報告為大腸菌群陰性。擴(kuò)展資料：有益菌菌群的生理功能：如果腸內(nèi)有益菌菌群占優(yōu)，腸內(nèi)黏膜呈現(xiàn)粉紅色，表示腸內(nèi)環(huán)境相當(dāng)良好。

1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄 在胃部分解消化的食物，經(jīng)由小腸吸收營養(yǎng)后，成為粘稠狀物體送至大腸。然后再經(jīng)過18小時將水分及礦物質(zhì)吸收，就變成容易排泄的糞便。

腸道內(nèi)環(huán)境良好時，糞便的軟硬適中，排便會較為順利。2、緩和的蠕動，能順利將糞便排出 藉由腸的蠕動，將糞便緩慢的推送至肛門。

如果蠕動過快或太慢，都將影響糞便的構(gòu)成，導(dǎo)致便秘或者腹瀉。而如果腸內(nèi)干凈，則蠕動的速度就相當(dāng)?shù)挠幸?guī)律，糞便可順利排出。

3、有助維他命的合成 比菲德氏菌等好菌能維護(hù)肌膚的健康，并具有合成有助熱量產(chǎn)生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關(guān)的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會不斷繁殖，維他命的合成也可順利進(jìn)行。

4、迅速排出有害物質(zhì) 健康的腸道并非完全沒有壞菌的存在，有害物質(zhì)多少會產(chǎn)生。當(dāng)然還包括，吃進(jìn)體內(nèi)的食品化學(xué)添加物或是無法成為營養(yǎng)成分的物質(zhì)。

只要腸內(nèi)環(huán)境良好，這些物質(zhì)在開始危害身體前就被排出體外。5、避免病原菌的侵害 比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身體的免疫機(jī)能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質(zhì)，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內(nèi)繁殖。

腸道有益菌菌群除了以上功能之外，對人體還有營養(yǎng)作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對人類的毛發(fā)具有重要的作用，當(dāng)缺少這些營養(yǎng)元素，會導(dǎo)致頭發(fā)脫落或毛發(fā)發(fā)黃、發(fā)叉，容易折斷等現(xiàn)象。

參考資料來源：百度百科-腸道菌群。

2.大腸菌群檢測方法及說明

一、大腸菌群介紹 大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。

調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。

大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。

糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。

二、大腸菌群檢驗方法： 由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行。

目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同。

（一）國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。 乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。

36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。

證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。

報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。 具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》 （二）原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。

本方法采用兩步法： 推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。

證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。

查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。 具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》 三、說明： 1.MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)（Most Probable Number）的簡稱。

這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。 MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。

注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報告單位也不相同。 2.初發(fā)酵和證實試驗： 無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。

初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。

因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。 3.產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。

實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗。

4.挑選菌落： 國家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。

國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。 另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌。