真菌性污染的檢測方法(微生物室常用的病原真菌檢查方法)
1.微生物室常用的病原真菌檢查方法有哪些
您好！
1、真菌鏡檢
是最簡單也是很有價值的實驗室診斷方法。其優(yōu)點在于簡便、快速，無菌部位的陽性結(jié)果可直接確定真菌感染。但是由于陽性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷。直 接鏡檢對于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標本中發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應(yīng)真菌病的可靠診斷。如在無菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌成分?？纱_立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細胞，或外周血涂片中檢測到莢膜組織胞漿菌細胞。但一般在 有菌部位則只有發(fā)現(xiàn)大量真菌菌絲方才有意義，通過直接鏡檢一般可以區(qū)分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進一步明確鑒定菌種需要通過 培養(yǎng)鑒定來完成。
2、真菌培養(yǎng)
真菌培養(yǎng)是實驗室檢查中的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)出致病真菌是進一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養(yǎng)第一步是從臨床標本中培養(yǎng)真菌的初代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后進一步進行 分離純化培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)。不同致病真菌每一步所采用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度存在一定的差異。常規(guī)的真菌培養(yǎng)需要在28-30°C溫度下培養(yǎng)3-4 周，一般初代培養(yǎng)選用沙氏培養(yǎng)基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），采用試管培養(yǎng)，一般同時培養(yǎng)兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養(yǎng)1周內(nèi)，應(yīng)該每天觀察有無真菌生長。一般培養(yǎng)4周后，如果無真菌生長可報陰性。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養(yǎng)后，用乳酸酚棉蘭 制成涂片顯微鏡下觀察，結(jié)合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據(jù)基本表現(xiàn)，采用適當?shù)臉藴疏b定培養(yǎng)基，標準培養(yǎng)條件培養(yǎng)，必要時要結(jié)合 生理學和分子生物學方法進行鑒定。
3、真菌鑒定
對常見致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區(qū)分酵母菌和霉菌。
如果初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)出酵母樣菌落，在鑒定前應(yīng)進行分離純化。在去除細菌和其他真菌污染，區(qū)分混合感染后，對純菌落進行鑒定。酵母菌鑒定主要根據(jù)形態(tài)學特 征和生理生化特點，按照一定的流程進行。首先根據(jù)菌落顏色進行分類。臨床最為常見的是白色或奶白色菌落，這類菌進一步做芽管試驗，若芽管試驗是陽性則為白 念珠菌，若陰性則通過Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養(yǎng)的形態(tài)特征來鑒定。另外，還可以應(yīng)用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗等試驗來輔助鑒定。
檢驗地帶網(wǎng)
霉菌的鑒定非常復(fù)雜，有許多標準包括形態(tài)學特征、溫度耐受性，放線菌酮抗性、雙相性、營養(yǎng)需求、蛋白分解活動以及水解尿素能力等?，F(xiàn)代分類學鑒定方法主要 依據(jù)分生孢子的個體發(fā)生過程結(jié)合其他特征來進行鑒定。初代培養(yǎng)后根據(jù)形態(tài)學特征一般可鑒定到屬的水平，再依據(jù)不同真菌的鑒定要求，采用標準培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件進一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時需要采用標準培養(yǎng)基，即察氏培養(yǎng)基和麥芽瓊脂，25℃培養(yǎng)7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對應(yīng)得到正確的結(jié)果。
2.怎樣檢測環(huán)境中的細菌和真菌
1、選取五套培養(yǎng)皿進行實驗，一個做為對比，另外四個用來培養(yǎng)不同環(huán)境中的細菌，并且是在不同的環(huán)境中培養(yǎng)，以便得出細菌和真菌的生存條件。
2、培養(yǎng)皿經(jīng)過高溫滅菌，準備至少5套培養(yǎng)皿。因為對比不同環(huán)境中的細菌與真菌的存在情況，是屬于單因素比較，所以除了采樣地點是變量外，進行微生物培養(yǎng)的條件等也要保持一致
3、經(jīng)過高溫處理后可以將培養(yǎng)皿上、培養(yǎng)基內(nèi)混有的細菌或真菌的孢子等殺死（經(jīng)過嚴格的高溫滅菌的環(huán)境中是不可能有細菌和真菌存在的），這樣就排除了實驗外其他環(huán)境的污染。因此，在實驗前不要盲目的打開培養(yǎng)皿，以防止細菌或真菌的孢子等落在培養(yǎng)基上，實驗中用無菌棉棒的目的同樣是為了防止棉棒上的微生物污染培養(yǎng)基。
4、在不同的環(huán)境中細菌的分布是不相同的，因此在采集菌種的時候要注意選擇環(huán)境，做到要有一定的代表性。
5、接種好的培養(yǎng)基要放在特定的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。
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3.曲霉菌感染檢測方法有哪些
GM抗原的檢測目前最主流的方法是經(jīng)典的一步法酶聯(lián)免疫試驗，目前國內(nèi)外廣泛認可的檢測產(chǎn)品是由美國Bio-Rad公司提供的曲霉菌抗原檢測試劑盒（），可快速、靈敏的發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的GM抗原，幫助臨床實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)曲霉菌感染。
GM抗原是曲霉菌半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原的簡稱，是曲霉菌胞壁的組成成分，在菌絲生長過程中可釋放人血液，檢測患者血清中GM抗原水平有助于侵襲性曲霉菌?。↖nvasive Aspergillosis, IA）的早期診斷。推薦首次檢測時間點一般為當臨床懷疑患者發(fā)生IA時，或者需要對免疫妥協(xié)患者進行常規(guī)篩查時。1另外，對于開始進行抗真菌治療的患者，推薦進行每周兩次的GM水平監(jiān)測，以幫助判斷臨床療效及患者預(yù)后。2
由于血清學試驗為間接檢測手段，除外檢測試劑盒的選擇，感染曲霉菌類型、宿主本身、以及使用的診斷標準和方法等，都可能影響檢測結(jié)果。所以在檢測過程中，需要注意各種影響的因素，以盡可能獲得準確的結(jié)果，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性而干擾了最終的臨床診斷，延誤患者診治。在不考慮檢測者本身操作原因及試驗環(huán)境污染等因素的前提下，我們來了解下哪些因素可能會影響試驗結(jié)果：3
生物學因素：
· 感染部位（比如鼻竇，肺部，還是播散性）
· 感染部位的微環(huán)境（比如營養(yǎng)，氧含量，PH值）
· 曲霉菌種類
· 是否使用抗真菌藥物
· 釋放的GM抗原分子結(jié)構(gòu)
· 患者免疫抑制的程度
· 腎臟清除率，肝代謝情況
· 患者體內(nèi)是否存在GM抗體
· 樣本的保存條件及時間
· 患者檢測前的治療情況
流行病學因素：
· 患者所屬人群
· 當?shù)馗腥玖餍新?/p>
· 樣本采集手段
· Cut-off值的設(shè)定
· 感染患者的界定標準
· 實驗室檢測經(jīng)驗
由于對結(jié)果的影響因素眾多，為了確保最終結(jié)果的準確性，選擇高質(zhì)量的檢測試劑盒就顯得至關(guān)重要，即便選擇了值得信賴的檢測產(chǎn)品，操作者在分析GM抗原檢測結(jié)果時，還是需要結(jié)合各種客觀的影響因素，為臨床提供最為準確可性的報告。
4.病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些
細菌 [what]什么是細菌？細菌（英文：germs;bacteria）隸屬生物學一類，是在自然界分布最廣、個體數(shù)量最多的有機體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。
細菌主要由細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構(gòu)成，有的細菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)細菌的直徑大小在0.5~5μm之間。
可根據(jù)形狀分為三類，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧形菌）。 還有一種利用細菌的生活方式來分類，即可分為兩大類：腐生生活與寄生生活。
（一）細胞壁 細胞壁厚度因細菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸構(gòu)成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。
n-乙酰胞壁酸分子上有四肽側(cè)鏈，相鄰聚糖纖維之間的短肽通過肽橋（革蘭氏陽性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。
革蘭氏陽性菌細胞壁厚約20~80nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40%的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌細胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復(fù)雜，由外向內(nèi)依次為脂多糖、細菌外膜和脂蛋白。
此外，外膜與細胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽性菌細胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌或殺菌作用。
如溶菌酶是n-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉(zhuǎn)肽酶的活性，抑制肽橋形成。 細菌細胞壁的功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷（革蘭氏陽性菌的細胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導細胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細胞運動和分裂。
脫壁的細胞稱為細菌原生質(zhì)體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細菌原生質(zhì)體，生存和活動能力大大降低。 （二）細胞膜 是典型的單位膜結(jié)構(gòu)，厚約8~10nm，外側(cè)緊貼細胞壁，某些革蘭氏陰性菌還具有細胞外膜。
通常不形成內(nèi)膜系統(tǒng)，除核糖體外，沒有其它類似真核細胞的細胞器，呼吸和光合作用的電子傳遞鏈位于細胞膜上。某些行光合作用的原核生物（藍細菌和紫細菌），質(zhì)膜內(nèi)褶形成結(jié)合有色素的內(nèi)膜，與捕光反應(yīng)有關(guān)。
某些革蘭氏陽性細菌質(zhì)膜內(nèi)褶形成小管狀結(jié)構(gòu)，稱為中膜體（mesosome）或間體（圖3-11），中膜體擴大了細胞膜的表面積，提高了代謝效率，有擬線粒體（chondroid）之稱，此外還可能與dna的復(fù)制有關(guān)。 （三）細胞質(zhì)與核質(zhì)體 細菌和其它原核生物一樣，沒有核膜，dna集中在細胞質(zhì)中的低電子密度區(qū)，稱核區(qū)或核質(zhì)體（nuclear body）。
細菌一般具有1-4個核質(zhì)體，多的可達20余個。核質(zhì)體是環(huán)狀的雙鏈dna分子，所含的遺傳信息量可編碼2000~3000種蛋白質(zhì)，空間構(gòu)建十分精簡，沒有內(nèi)含子。
由于沒有核膜，因此dna的復(fù)制、rna的轉(zhuǎn)錄與蛋白的質(zhì)合成可同時進行，而不像真核細胞那樣這些生化反應(yīng)在時間和空間上是嚴格分隔開來的。 每個細菌細胞約含5000~50000個核糖體，部分附著在細胞膜內(nèi)側(cè)，大部分游離于細胞質(zhì)中。
細菌核糖體的沉降系數(shù)為70s，由大亞單位（50s）與小亞單位（30s）組成，大亞單位含有23srrna,5srrna與30多種蛋白質(zhì)，小亞單位含有16srrna與20多種蛋白質(zhì)。30s的小亞單位對四環(huán)素與鏈霉素很敏感，50s的大亞單位對紅霉素與氯霉素很敏感。
細菌核區(qū)dna以外的，可進行自主復(fù)制的遺傳因子，稱為質(zhì)粒（plasmid）。質(zhì)粒是裸露的環(huán)狀雙鏈dna分子，所含遺傳信息量為2~200個基因，能進行自我復(fù)制，有時能整合到核dna中去。
質(zhì)粒dna在遺傳工程研究中很重要，常用作基因重組與基因轉(zhuǎn)移的載體。 胞質(zhì)顆粒是細胞質(zhì)中的顆粒，起暫時貯存營養(yǎng)物質(zhì)的作用，包括多糖、脂類、多磷酸鹽等。
（四）其他結(jié)構(gòu) 許多細菌的最外表還覆蓋著一層多糖類物質(zhì)，邊界明顯的稱為莢膜（capsule），如肺炎球菌，邊界不明顯的稱為粘液層（slime layer），如葡萄球菌。莢膜對細菌的生存具有重要意義，細菌不僅可利用莢膜抵御不良環(huán)境；保護自身不受白細胞吞噬；而且能有選擇地粘附到特定細胞的表面上，表現(xiàn)出對靶細胞的專一攻擊能力。
例如，傷寒沙門桿菌能專一性地侵犯腸道淋巴組織。細菌莢膜的纖絲還能把細菌分泌的消化酶貯存起來，以備攻擊靶細胞之用。
鞭毛是某些細菌的運動器官，由一種稱為鞭毛蛋白（flagellin）的彈性蛋白構(gòu)成，結(jié)構(gòu)上不同于真核生物的鞭毛。細菌可以通過調(diào)整鞭毛旋轉(zhuǎn)的方向（順和逆時針）來改變運動狀態(tài)。
菌毛是菌體表面極其的蛋白纖細，須用電鏡觀察。特點是：細、短、直、硬、多，菌毛與細菌運動無關(guān)，根據(jù)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類。
前者與細菌吸附和侵染宿主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質(zhì)有關(guān)。 （五）繁殖 細菌一二分裂的方式繁殖，某些細菌處于不利的環(huán)境，或耗盡營養(yǎng)時，形成內(nèi)生孢子，又稱芽孢，是對不良環(huán)境有強抵抗力的休眠體，由于芽胞在細菌細胞內(nèi)形成，故常稱為內(nèi)生孢子。
芽孢的生命力非常頑強，有些湖底沉積土中的芽抱桿茵經(jīng)500-1000年后仍有活力，肉毒梭菌的芽孢在ph 7.0時能耐受100℃煮沸5-9.5小。
