病毒的分離培養(yǎng)方法(病毒的培養(yǎng)方法)
1.病毒的培養(yǎng)方法有哪些
病毒的培養(yǎng)方法： （1）動物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進入易感動物的體內(nèi)后可大量增殖，并使動物產(chǎn)生特定的反應。
優(yōu)點：操作方面易行。缺點：受機體免疫力的影響，常需要用無菌動物。
運用：分離、增殖病毒，疫苗效力試驗，疫苗和抗血清的生產(chǎn)。 （2）雞胚培養(yǎng)：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內(nèi)，羊膜腔，尿囊腔等部位。
病毒生長的標志為雞胚死亡、畸型和出血。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。
（3）組織培養(yǎng)：在離體活細胞上培養(yǎng)病毒的方法 1）組織塊培養(yǎng)：取組織片（如一段胎兒氣管或一小塊鼻黏膜）進行培養(yǎng)。 2）細胞培養(yǎng)：病毒感染細胞后，大多數(shù)引起細胞病變，稱為病毒的致細胞病變作用。
表現(xiàn)為細胞變形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆?；藵饪s、核裂解等。
2.目前病毒分離培養(yǎng)的主要方法是哪一種
1.動物接種
這是最原始的病毒培養(yǎng)方法。常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠百、兔和猴等，接種的途徑有鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腦內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈等。根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位。
2.雞胚接種雞胚對多種病度毒敏感。根據(jù)病毒種類不同，可將標本接種于雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜上。
3.組織培養(yǎng)
將離體活組織塊或分散的活細胞加回以培養(yǎng)，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)法有三種基本類型：器官培養(yǎng)、移植培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)最常答用于培養(yǎng)病毒，根據(jù)細胞的來源，染色體特性及傳代次數(shù)又可分為下列類型：原代和次代細胞培養(yǎng)，二倍體細胞株和傳代細胞系。
3.病毒分離培養(yǎng)的方法是什么
1）病毒分離培養(yǎng)：用人成纖維細胞分離培養(yǎng)，但通常需要3~14天方可觀察到CPE，一般需觀察28天，病變組織標本涂片的常規(guī)HE染色，也可直接觀察CPE和核內(nèi)嗜堿性包含體。
2）抗原檢測：應用特異性抗體作免疫熒光，直接檢測白細胞、活檢組織、組織切片、支氣管肺泡洗液等臨床標本中的CMV抗原。3）病毒核酸檢測：應用PCR與核酸雜交等方法，可快速、敏感地檢測CMV特異性的DNA片段。
4）抗體檢測：特異性IgG類抗體需測雙份血清以作臨床診斷，同時了解人群感染狀況；IgM抗體只需檢測單份血清以確定活動性CMV感染。
4.病毒的培養(yǎng)方法有哪些
病毒的培養(yǎng)方法有動物接種、雞胚培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)。
1、動物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進入易感動物的體內(nèi)后可大量增殖，并使動物產(chǎn)生特定的反應。優(yōu)點：操作方面易行。
缺點：受機體免疫力的影響，常需要用無菌動物。疫苗和抗血清的生產(chǎn)。
2、雞胚培養(yǎng)：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內(nèi)，羊膜腔，尿囊腔等部位。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。
3、組織培養(yǎng)：在離體活細胞上培養(yǎng)病毒的方法，組織塊培養(yǎng)：取組織片進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)：病毒感染細胞后，大多數(shù)引起細胞病變，稱為病毒的致細胞病變作用。
表現(xiàn)為細胞變形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆?；?，核濃縮、核裂解等。4、采用該病毒所寄生的細胞的全素培養(yǎng)基來培養(yǎng)該細胞，培養(yǎng)一段時間后放進特定的病毒就可以培養(yǎng)了，注意，若細胞是動物細胞時培養(yǎng)基要加入血清。
5.病毒的提取,培養(yǎng),及其觀察的方法
一）、莖尖脫毒 1、莖尖脫毒的依據(jù)。
病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的，越接近生長點約（0.1-1mm區(qū)域），病毒濃度越稀，因此有可能采用小的莖尖離體培養(yǎng)而脫除植物病毒。 2、莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的技術關鍵 （1）、被脫毒植物攜帶病毒的診斷及其在體內(nèi)的分布 再脫毒之前，應了解植物攜帶何種病毒，病毒在體內(nèi)的分布位置，以確定培養(yǎng)莖尖的大小 （2）、母體植株的選擇和預處理 母體的選擇： 欲脫毒材料的品種典型性：關系到脫毒以后的脫毒苗是否保持原品種的特征特性 植體健康程度選擇：應選感病輕、帶毒量少的健康植株作為脫毒的外植體材料，這樣更容易獲得脫毒株。
外植體預處理： （3）、莖尖的剝離 在剝?nèi)∏o尖時，把莖芽置于解剖鏡下（8~40倍），一只手用鑷子將其按住，另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進行冷卻。
當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶1-2枚幼葉，然后將其接到培養(yǎng)基上。接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。
剝離莖尖時，應盡快接種，莖尖暴露的時間應當越短越好，以防莖尖變干。可在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行操作，有助于防止莖尖變干。
將接種好的莖尖置于25℃左右的溫度下。每天以16小時 2000-3000lx的光照條件下培養(yǎng)。
由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。
繼代培養(yǎng)得到足夠的檢測苗、進行病毒檢測。 （4）、脫毒效果檢測 A 指示植物鑒定（indicator test plants） 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性癥狀的寄主植物。
每種病毒都有自己敏感的植物，例如： 馬鈴薯病毒的敏感植物有千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼佗羅 大麗花病毒的敏感植物為：矮牽牛、黃瓜、莧色蘺 菊花病毒：矮牽牛、豇豆 指示植物鑒定病毒的方法 a.摩擦接種法： 取培養(yǎng)植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），磨成勻獎，將其涂抹在指示植株葉片上，在指示植物的葉片撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片。5分鐘后用清水清洗葉面。
將指示植株放于防蚜蟲網(wǎng)罩的溫室內(nèi)。然后視其病斑的有無，來判斷是否脫除了病毒。
例如：植物液接種后如使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內(nèi)具有馬鈴薯X病毒 b、嫁接法 有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進行傳播的。這種病毒的鑒定，需將培養(yǎng)植株的芽嫁接在敏感植物上，根據(jù)敏感植株的病癥來判斷是否脫除了病毒 B 血清鑒定（serologic test） 試管沉淀反應；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。
a、試管沉淀反應 在抗原-抗體最適比例的條件下，觀察有無沉淀的產(chǎn)生來確定被測植株是否帶病毒。試管沉淀反應操作簡單，需注意的問題： ①、葉綠體的自發(fā)凝聚 可用磷酸緩沖液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，pH 保持在6.5-8.5） ② 、抗原抗體的比例要適當，當抗原過量時回抑制沉淀的形成 b、免疫雙擴散 在半固體凝膠中測定在其中擴散的抗原和抗體間的沉淀反應的方法。
與沉淀法比較起來有兩個優(yōu)點：一是節(jié)約血清，二是汁液不用特殊處理。 步驟： ①倒膠，一般厚2mm ②打孔，多打成梅花型 ③加樣，加血清和汁液。
一般加樣后在37℃恒溫過夜，即可進行結果觀察。有擴散沉淀的即為帶毒株，沒有則為不帶毒株 c、酶連免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 它是將抗原、抗體的免役反應和酶的高效催化反應有機結合起來的一種綜合性技術。
即通過化學的方法將酶與抗體或抗原結合起來，形成酶標記物。然后將它與相應的抗原或抗體起反應，形成酶標記的免疫復合物。
結合在免疫復合物的酶，在遇到相應的底物時，催化無色底物生成有色底物，通過比色計可以準確測定。優(yōu)點是靈敏度高，測定快速，每次可以同時測定多個樣品。
C 電鏡檢查法 采用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可以進一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結構，這些特征相當穩(wěn)定，因此電鏡檢查法即準確又有效，但需要有一定的設備和技術。 D 分子檢測法 例如RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation)將待測的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進行反應，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設計引物進行PCR反應，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達 n 脫毒苗的離體保存與繁殖：一般是在實驗室進行，一般每月繼代一次，可以在培養(yǎng)基中加入生長延緩劑，如B9和矮壯劑可2-3個月繼代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存 n 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡體系：如果試管苗生產(chǎn)成本過高或移栽困難，可將試管苗選擇種植在一定的控制區(qū)域，從繁殖技術和環(huán)境隔離上保證較高水平，使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染 （5） 影響脫毒效果的因素 n 母體材料病毒侵染的程度：單一病毒。
