測定蛋白質不同結構的方法(測定蛋白質含量的方法,其原理各是什么)
1.測定蛋白質含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質濃度 （一）實驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋 白質溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點是： （1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質與染料結合后產生 的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。
完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的 過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。 （3）干擾物質少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
2.蛋白質含量測定的不同方法比較
蛋白質含量測定法，是生物化學研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10~20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。
值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質的性質；③溶液中存在的干擾物質；④測定所要花費的時間。
考馬斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應用。
3.蛋白質定量測定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時
8~10小時 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離） 用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化
考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質變化
